３．小胞体ストレスと神経変性疾患
近年、小胞体ストレスと様々な疾患（糖尿病・虚血性疾患・神経変性疾患・癌疾患など）の関係が明らかになっています。そのなかで私たちは、特に神経変性疾患と小胞体ストレスの関係について焦点をあて、研究を進めています。
・ポリグルタミン病
ハンチントン病やマシャドヨセフ病などのポリグルタミン病は、原因遺伝子内におけるCAGの繰り返し数の増加によるポリグルタミンタンパク質が中枢神経細胞内に蓄積し、不溶性凝集塊を形成することによって発症する遺伝性の神経変性疾患です。マウス初代培養神経細胞にポリグルタミンタンパク質を発現させることにより、小胞体ストレスが惹起されること、さらにASK1-JNK経路が強く活性化されることが明らかになりました。また、ASK1-/-神経細胞を用いた実験により、ポリグルタミン誘導性神経細胞死おけるASK1の必要性が示されました。一方、小胞体の外に存在するポリグルタミンタンパク質が、どのようにして小胞体ストレスを誘導するかについては、その蓄積によってプロテアゾーム活性の低下が観察されており、これによりERADを介した小胞体内不良タンパク質の分解が抑制され、結果的に小胞体内腔に異常タンパク質が徐々に蓄積すると考えられます（Nishitoh et al. Genes Dev. 2002）。
・筋萎縮性側索硬化症
筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis；ALS）は、運動神経が特異的に障害されるきわめて重篤な進行性神経変性疾患です。日本国内の罹患者数は約7000人。現在の治療法は、リハビリテーションによる筋力低下予防と、グルタミン酸神経終末放出抑制剤による一時的な進行遅延だけで、ALS病態分子メカニズムに基づく根本的な治療法はありません。家族性ALSの原因として1993年に発見されたCu/Zn superoxide dismutase 1（SOD1）の遺伝子変異は、家族性だけでなく孤発性ALSの病態解明にも飛躍的な進歩をもたらすと期待されていますが、これまで治療標的となる分子メカニズムは明らかにされていませんでした。私たちは、ALSの病態分子メカニズムとして、ERADの機能低下による小胞体ストレス誘導性アポトーシスの関与を明らかにしました（Nishitoh et al. Genes Dev. 2008）。
図４：変異型SOD1による小胞体ストレス誘導と運動神経細胞死： (A)小胞体関連分解（ERAD）の流れ(B)変異型SOD1はDerlin-1に結合し、ERAD基質の流れを阻害し、その結果小胞体ストレス誘導性のASK1活性化が惹起され、運動神経細胞死が起こる。中央のパネルはIRE1活性化によるリン酸化とASK1の活性化（in vitroキナーゼアッセイ）を、下のパネルは変異型SOD1による運動神経細胞死を示す。(C)変異型SOD1結合領域の12アミノ酸CT4は、変異型SOD1-Derlin-1結合を競合阻害し運動神経細胞死を抑制する。
i) 変異型SOD1による小胞体関連分解（ERAD）の抑制
小胞体内不良タンパク質は、小胞体膜を逆輸送され（図４A,①）、続いてE3ユビキチンリガーゼによってポリユビキチン化（②）、プロテアソームによって分解されます（③）。このERAD基質タンパク質の逆輸送過程には、小胞体膜に存在するDerlinファミリー分子が関与しています。運動神経系（NSC34）細胞に、3種類の変異型SOD1（SOD1A4V, SOD1G85R, SOD1G93A）を発現させたところ、小胞体受容体IRE1（図４B）, PERKの活性化が観察されました。SOD1は主に細胞質内に発現するため、どのようにして小胞体内腔に不良タンパク質を蓄積させるかが疑問であったため、ERAD基質タンパク質の分解速度を検討したところ、野生型SOD1に比べて変異型SOD1の共発現によって有意に遅延したことから、変異型SOD1は何らかのメカニズムを介して、ERAD経路を特異的に抑制していることが示唆されました。
ii) 変異型SOD1とDerlin-1の特異的結合
変異型SOD1は、様々な分子と結合することが報告されています。そこで、ERAD抑制にはERAD複合体（図４A）と変異型SOD1の結合が関与していると予想し、それらの結合をin vitroで検討したところ、Derlin-1という4回膜貫通型分子に結合し、その結合はNSC34細胞などの培養細胞、SOD1G93Aトランスジェニック（ALS）マウス脊髄を用いた実験でも確認されました。また、他のDerlinファミリー分子Derlin-2, -3には全く結合しなかったことなどから、変異型SOD1はERAD複合体分子のなかで、きわめて特異的にDerlin-1に結合するといえます。その結合領域に関する詳細な検討の結果、Derlin-1(C末端)の12アミノ酸領域を同定しました。
iii) Derlin-1の獲得性機能障害
Derlinファミリーは同定された当初、逆輸送孔（レトロトランスロコン）を構成する分子の一つと予想されましたが、現在まで明確な実験的証拠は得られておらず、ERADの機能に必要な分子であることは示されているものの、どのような役割を担っているかは不明です。変異型SOD1は、ERAD基質のユビキチン化を強く抑制したことから、変異型SOD1はERADの「流れ」を抑制し、その結果小胞体不良タンパク質を蓄積させていると予想されました（図４B）。変異型SOD1はDerlin-1の機能を単に喪失させているのではなく、獲得性機能異常を引き起こすことで、小胞体ストレスを誘導しています。現在は、変異型SOD1がいったいどのようなDerlin-1機能障害を引き起こしているのかを明らかにし、さらにそれによってDerlin-1の生理的機能を解明しようと試みています。
iv) 小胞体ストレス-ASK1経路を介した運動神経細胞死
変異型SOD1依存的に小胞体ストレスが誘導されることから、ASK1経路について検討したところ、 TRAF2-ASK1の結合と、それに伴うASK1の活性化が観察されました（図４B）。この経路が、運動神経細胞死に関与するか否かを検討するため、マウス胎児の脊髄培養系を用いての変異型SOD1依存的運動神経細胞死実験系に（図４B）、変異型SOD1-Derlin-1結合を阻害するCT4ペプチド（12アミノ酸）を発現させたところ、運動神経細胞死が有意に抑制されるとともに（図４C）、ASK1ノックアウトマウス由来の細胞でも同様の結果が得られました。さらに、ALSマウスとASK1-/-マウスの交配実験を行った結果、ALSマウスでみられる脊髄前角部運動神経細胞変性がASK1-/-マウスで抑制され、生存期間の有意な延長がみられました。
従って、変異型SOD1とDerlin-1の結合を介した小胞体ストレス誘導性ASK1活性化が運動神経細胞死を誘導し、これらのメカニズムがALSの病態進行に深く関わっていることが示されました。
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